Измерение концентрации лекарственных препаратов в крови является широко применяемым в клинике исследованием, помогающим правильно определить дозу того или иного препарата. Обычно определяют общую концентрацию лекарства в цельной крови или плазме. Однако, общая концентрация лекарства складывается из двух составляющих: той части препарата, которая связана с белками плазмы и той части, которая не связана, то есть свободна. Факторы, влияющие на связывание препарата с плазмой, изменение фармакокинетики и фармакодинамики, возникающие вследствие связи препарата с плазмой и являются предметами обсуждения в настоящем обзоре.
  После того, как препарат попадает в системный кровоток, он доставляется к месту своего действия, метаболизма и экскреции. В крови многие препараты обратимо соединяются с белками плазмы крови, и этот процесс может быть выражен следующим уравнением:

  Методы

  Уровень присоединения препарата к белкам плазмы обычно определяется двумя методами: уравнительным диализом или ультрафильтрацией, причем уравнительный диализ используется более часто. В этом случае плазма или раствор, содержащий белок, помещается в диализную камеру, в другой отсек которой заливают раствор, не содержащий белка (обычно это фосфатный буфер). Плазма и буферный раствор разделены полупроницаемой мембраной с порами такого размера, что белок через нее не проходит, тогда как молекулы препарата, не связанные с белком, свободно проходят через эту мембрану. К буферному раствору добавляется известная концентрация препарата и по достижении равновесия, то есть когда свободная фракция препарата в плазме равна известной концентрации препарата в буферном растворе, разделенной на общую концентрацию препарата в плазме. Поскольку свободная концентрация препарата обычно бывает относительно низкой, то часто применяется радиоактивный меченый препарат. Этот метод прост и точен и требует небольших по объему образцов.
  Если образец фильтруют под давлением через полупроницаемую мембрану, то свободная от белка фаза фильтрата содержит только свободную фракцию препарата - этот процесс известен, как ультрафильтрация. Зная исходную концентрацию препарата и концентрацию препарата в ультрафильтрате, легко высчитать, какая его часть связана с белками плазмы. Главное преимущество этого метода - это его быстрота, однако потенциальный недостаток - изменение концентрации белка вследствие прохождения молекул растворителя через мембрану. Модификация ультрафильтрации, диафильтрация, включает в себя систему замещения этого потерянного объема, чем предупреждается изменение концентрации. Принято считать, что и метод ультрафильтрации, и метод уравнительного диализа эквивалентны и дают одинаковые результаты.
  В прошлом исследования по присоединению лекарственных препаратов к белкам плазмы крови часто производились in vitro с использованием буферных систем с не физиологичными рН и температурой, что может сильно влиять на процесс. рН сыворотки или плазмы может значительно влиять на связывание лидокаина с плазмой, например, при увеличении рН увеличивается и степень присоединения лидокаина к белкам плазмы крови. К тому же, на связь, например, промедола с плазмой крови влияет и температура - чем она выше, тем хуже промедол соединяется с белками.
  Таким образом, детерминанты связи препаратов с белками плазмы крови в значительной степени зависят от как от рН, так и от температуры. Другая проблемы была в использовании неадекватных концентраций препаратов. Поскольку концентрация свободной фракции может быть относительно низкой, то при использовании обычных терапевтических концентраций концентрация свободной фракции была меньше, чем чувствительность их методики и вследствие этого исследователи использовали очень высокие концентрации препарата и получали очень высокие значения концентрации свободной фракции, что могло дать неверные результаты вследствие наличия нелинейной зависимости. Когда количество препарата в плазме повышается, то превышается связывающая способность белков плазмы, резко повышается свободная концентрация, получается очень высокий результат и токсичный эффект. Это может оказать огромное влияние на оценку фармакокинетики и токсичности лекарственного препарата. По этим причинам , в идеале исследование связывания препарата с белками плазмы крови должно происходить при физиологических значениях рН и температуры и необходимо использовать такие концентрации препарата, которые лежат в пределах физиологических доз.
  Во многих таких исследованиях использовался альбумин и другие белковые фракции, полученные от животных разных видов, а полученные результаты экстраполировали на человека. Однако исследования по присоединению лекарственных препаратов к белкам плазмы крови, проведенные даже на очищенных растворах человеческого альбумина, не всегда могут предсказать действительное течение процесса в физиологических условиях, например, измерения, касающиеся панкурония и его связи с очищенным альбумином и растворами очищенных глобулинов показали, что панкурониум является высоко связываемым препаратом со свободной фракцией в 13%. В действительности, однако, связываемость панкурониума с белками плазмы человека оказалась низкой, и его свободная фракция на самом деле составляет 93.2%.
  Хотя присоединение препаратов к белкам плазмы крови человека может быть измерено in vitro, не существует не единого метода измерения этого процесса in vivo. Однако, используя тот факт, что ликвор и слюна относительно свободны от белка, возможно пользоваться отношениями концентраций препаратов в слюне / плазме или в ликворе / плазме, чтобы получить значение свободной фракции того или иного препарата in vivo. После получения результатов их сравнивают с результатами, полученными in vitro, например, методом уравнительного диализа.
  Практически во всех публикациях очень малое внимание уделяется связи лекарственных препаратов с эритроцитами или вообще с цельной кровью. Ведь в организме препарат попадает именно в кровь, а не в плазму, поэтому результаты, полученные при использовании в эксперименте цельной крови, а не плазмы, следует считать наиболее точными и соответствующими действительности. Конечно, технически гораздо легче проводить эксперименты с плазмой, чем с цельной кровью, однако во многих публикациях использовались отношения концентрации препарата в цельной крови и плазме для того, чтобы оценить связь препарата со всеми компонентами цельной крови, а не результаты прямого эксперимента с использованием цельной крови.
  При исследовании связывания препарата с белками плазмы крови перед экспериментатором встает ряд методологических проблем. Первый важный момент- это техника забора пробы крови. Если кровь собирают в побирки, покрытые слоем силикона или специальной пластмассы, то процесс связывания препарата с белками ингибируется, поскольку эфир трибутооксиэтилфосфата, используемый для этих целей увеличивает свободную фракцию препарата, поскольку он способствует распаду комплекса препарата с альфа-1-кислым гликопротеином. Сейчас большинство пробирок производится без использования этого вещества. В клинических исследованиях также часто применяется гепарин, как антикоагулянт и средство для предотвращения тромбирования катетеров - так называемый "гепариновый затвор". Гепарин увеличивает концентрацию в плазме свободных жирных кислот путем активации липопротеинлипазы, и многие исследования показали, что после введения больным гепарина связывание препаратов с белками ухудшается. При исследовании in vitro гепарин оказывает минимальное влияние на этот процесс, поскольку концентрация свободных неэстерифицированных жирных кислот увеличивается ненамного. Однако активность липопротеинлипазы может изменяться даже при проведении уравнительного диализа при температуре 37 градусов. Напротив, in vivo при использовании гепарина свободных жирных кислот образуется очень много и поэтому концентрация свободной фракции будет довольно значительно увеличиваться. Необходимо, чтобы до получения проб гепарин больному не вводили, в противном случае будут получены ложные результаты концентрации свободной фракции.

  Белки, с которыми связываются лекарства

  В плазме за связывание с лекарствами отвечают три главных белка: альбумин, кислый альфа-1 гликопротеин и липипротеины. Препараты могут связываться не только с одним белком. Например, преднизолон связывается с альбумином, гликопротеином, и транскортином, тогда как фентанил и его аналоги связываются с альбумином, гликопротеином и некоторыми фракциями альфа и бета глобулинов.
  Альбумин, главный белок в процессе связывания, составляет примерно 60 % от общего количества белков в плазме крови, связывает множество лекарственных препаратов, например, сульфаниламиды, пенициллины и бензодиазепины, а также множество эндогенных веществ, таких, как жирные кислоты и билирубин. Большинство препаратов, имеющих кислую реакцию связываются именно с альбумином. Хотя препараты, имеющие щелочную реакцию, также связываются при некотором избытке с альбумином, в плазме связывание таких лекарств, как пропранолол, лидокаин, хинидин и хлорпромазин, происходит не только с альбумином. В недавней публикации было доказано, что основным связывающим белком для основных или катионных препаратов, является альфа-1 гликопротеин, известный также, как оросомукоид. В таблице 1 указаны, препараты, присоединяющиеся к нему. Альфа-1 кислый гликопротеин (АГК) является белком острой фазы воспаления, концентрации которого в крови резко повышены при злокачественных опухолях и воспалении. Недавно было обнаружено, что изменения концентрации АГК в плазме при указанных патологических состояниях могут являться причиной изменений свободных фракций многих основных препаратов, которые в плазме связываются именно с этим белком. При хронических воспалительных заболеваниях, например, ревматоидном артрите и болезни Крона , связанных с повышением концентрации АГК приводит к увеличению вследствие этого связанной фракции таких препаратов, как хлорпромазин и пропранолол, которые оба имеют высокое сродство к данному белку. Хирургическое вмешательство, травма и хронический болевой синдром также связаны с повышением концентраций в плазме АГК.
  Лекарственные препараты также могут связываться с другими белками плазмы , такими, как липопротеины и глобулины. Тубокурарин, например, присоединяется к растворам изолированных глобулинов. Плазменные липопротеины, которые транспортируют жирные кислоты, триглицериды, фосфолипиды и холестерол, могут отвечать за связь с белками таких лекарственных препаратов, как хлопромазин, и имипрамин. Как говорилось выше, препараты также могут присоединяться к эритроцитам. Пропранолол, например, связывается не только с белками плазмы, такими, как АГК, но и с эритроцитами, следуя основным фармакологическим принципам, о том, что влияет на прохождение препарата через мембраны: связь с белками, ионизация и растворимость в жирах, таким образом, что отношение концентрации препарата в цельной крови к его концентрации в плазме (отношение В/Р) линейно зависит (прямо пропорционально) свободной фракции пропранолола в плазме.

  Места присоединения ( рецепторы) и аффинитет

  Лекарственные препараты и мелкие эндогенные молекулы присоединяются к белкам крови и тканей в соответствии законам взаимодействия масс. Аналогичным образом, связь препарата с белками может оцениваться количеством мест присоединения (n) и уравнением константы ассоциации (Ка), которая является мерой аффинитета.

Факторы, вляющие на связывание лекарственных препаратов

  Возраст и беременность

  Связывание препаратов с белками плазмы у беременной, плода и новорожденного является очень важной проблемой, поскольку переход препарата через плаценту определяется только свободной фракцией. У новорожденных детей и беременных женщин снижено количество сывороточного альбумина, а у новорожденного концентрация АГК в плазме крови снижена по сравнению с таковой у взрослых. На поздних сроках беременности связывание многих препаратов, имеющих кислую реакцию, снижено. Низкие концентрации альбумина в плазме могут объяснить, почему у новорожденных некоторые лекарственные препараты связываются хуже, однако также существует предположение, что у новорожденных альбумин обладает более низкой связывающей способностью, чем у взрослых. Свободные фракции пропранолола, лидокаина, бупивакаина, промедола, ампициллина, фенобарбитала, фенитоина, имипирамина, диазоксида, д-тубкурарина и метокурина в плазме крови из пуповины гораздо выше, чем в плазме крови взрослого человека. Связывание панкурония у новорожденных такое же, как и у взрослого. Свободные фракции промедола, бупивакаина и пропранолола (о которых известно, что они связываются с АГК) у новорожденного увеличены, поскольку у новорожденного в плазме больше АГК, чем у взрослого. Напротив, свободная фракция диазепама, который связывается только с альбумином, выше в плазме крови матери, чем в крови, взятой из пупочной вены. К тому же, по сравнению с небеременными женщинами, у беременных женщин связывание диазепама ниже. Разница в связывании диазепама во время беременности и у новорожденного может быть объяснена тем, что в этом случае концентрации свободных жирных кислот выше, а концентрации альбумина в крови матери ниже. Итак, становится важным знание концентраций основных связывающих белков (особенно АГК) для того, чтобы предсказать изменения связывания препаратов у матери и новорожденного.
  В старческом возрасте концентрация альбумина плазмы крови имеет тенденцию снижаться, тогда как концентрации в плазме АГК, по данным некоторых исследований, повышается. В старческом возрасте изменяется связывание многих лекарств, причем свободные фракции таких препаратов, как тиопентал, этомидат и темазепам, увеличиваются. Что же касается данных о связывании диазепама в старческом возрасте, то данные об этом весьма противоречивы, но когда были доказаны изменения в связывании диазепама, выяснилось, что они связаны с тем, что с возрастом изменяется концентрация сывороточного альбумина. Важно знать, что изменения связывания препаратов у здоровых стариков очень малы по сравнению с теми, которые наблюдаются у пожилых людей при различных патологических состояниях.

  Влияние пола на связывание препаратов с белками плазмы

  Концентрации альбумина в плазме крови понижаются с возрастом как у мужчин, так и у женщин, Однако особой разницы между полами отмечено не было. К тому же, концентрация в плазме АГК у мужчин и небеременных женщин практтически одинакова. Связывание с белками плазмы д-тубокурарина, метокурина, пропранолола, лидокаина, оксазепама, диазепама, хлорпромазина, дезипирамина и фенитоина у обоих полов происходит в равной мере, но свободные фракции диазепама и лидокаина больше у тех небеременных женщин, которые принимают оральные контрацептивы, чем у здоровых небеременных женщин того же возраста, которые не принимают оральных контрацептивов. В общем, пол играет весьма незначительную роль среди тех факторов, которые оказывают влияние на процесс связывания лекарственных препаратов с белками плазмы крови.

  Патологические состояния

  Изменения в процессе связывания лекарственных препаратов с белками наблюдаются при многих патологических состояниях. Это может быть связано с изменением концентрации некоторых белков в условиях патологии (например, изменение концентрации АГК и альбумина), изменения аффинитета, модификации уровня ионизации препарата и белка, а также конкуренцией между препаратами и эндогенными лигандами , например, снижение связывания в результате повышения концентрации свободных жирных кислот .

  Заболевания почек

  Препараты, имеющие кислую реакцию, избирательно присоединяются к альбумину. Таким образом, гипоальбуминемия приводит к снижению связывающей способности плазмы крови. Это наблюдается при хронических заболеваниях почек. Однако, при патологии почек даже при наличии нормальной концентрации сывороточного альбумина, уменьшается связывание некоторых лекарственных препаратов, например, фенитоина. Уровень связывания фенитоина плазмой коррелирует с тяжестью почечной недостаточности, которая определяется концентрацией азота мочевины в крови и концентрацией креатинина в сыворотке крови. Корреляция между снижением связывания фенитоина и тяжестью азотемии не зависит от гипоальбуминемии, что позволяет предположить, что низкие концентрации альбумина в крови не являются исчерпывающим объяснением того факта, что при почечной патологии связывание фенитоина снижается. Это может быть связано с тем, что рецепторы на белках уже заняты каким-то продуктом метаболизма, который в норме выводится почками, или рецептор занят молекулой неэстерифицированной жирной кислоты, концентрация которых в крови при уремии возрастает, особенно после назначения гепарина при проведении гемодиализа. Другое объяснение - изменение структуры белка при такой патологии. Такие органические кислоты, какими являются фенитоин, сульфаниламиды, тироксин, клофибрат, салицилат, тиопентал, диазоксид, фенилбутазон, этомидат и бензилпенициллин, плохо связываются белками плазмы крови, полученной от больных с почечной недостаточностью.
  Связывание белками плазмы крови основных лекарственных препаратов у больных с патологией почек может быть нормальным, сниженным, или повышенным. Изменения этого процесса зависят как от относительных концентраций альбумина и АГК, так и от типа патологии почек. Итак, у больных с почечной недостаточностью, нефротическим синдромом и реципиентов трансплантантов почек связывание диазепама, который связывается исключительно с альбумином, снижено, вероятнее всего, за счет снижения концентрации альбумина в плазме. Напротив, связывание лидокаина, котрый связывается исключительно с АГК, у больных с уремией и перенесших трансплантацию почки, повышено, а у больных с нефротическим синдромом - нет, возможно, вследствие того, что концентрация альбумина у таких больных понижена, а концентрация АГК- нет. Связывание пропранолола и хлорпромазина у больных с воспалительными заболеваниями почек повышено, поскольку у них повышено содержание АГК как белка острой фазы воспаления. Связывание морфина у больных с почечной недостаточностью несколько снижено.
  Связывание с белками миорелаксантов панкуронияи д-тубокурарина при почечной патологии не изменяется.

  Патология печени

  Ожоги

  При ожогах наблюдается значите6льное изменение связывания лекарств белками плазмы. Концентрация альбумина после термических ожогов либо не изменяется, либо уменьшается, тогда как концентрация АГК в плазме увеличивается. Связывание имипирамина повышается и его свободная фракция уменьшается после тяжелых термических ожогов, коррелируя с концентрацией АГК. Напротив, свободная фракция диазепама, который связывается только альбумином, у обожженных гораздо выше таковой у здоровых, предположительно вследствие снижения концентрации альбуминов. Д-тубокурарин после ожогов связывается с белками несколько интенсивнее.

  Инфаркт миокарда

  При инфаркте миокарда регистрируется повышение концентрации в плазме АГК, однако не для всех больных это является правилом. Общая концентрация лидокаина в плазме крови со временем у больных, получающих его длительные инфузии, увеличивается. Увеличение связывания лидокаина, возможно, происходит вследствие наблюдаемых изменений концентрации АГК в плазме крови. Неясно, что в этой паре является первичным, а что вторичным. Увеличение концентрации АГК в плазме после инфаркта также связано с увеличением связывания пропранолола.

  Хирургическое вмешательство

  После травмы или хирургического вмешательства в физиологии и метаболизме наблюдаются значительные изменения. Во время катаболической фазы после травмы увеличиваются потери азота и распад альбуминов. Также изменяется распределение веществ в межклеточном пространстве. Эти изменения приводят к снижению концентрации альбумина в плазме после хирургического вмешательства, тогда как концентрация глобулинов может возрастать, в результате чего снижается индекс альбумин/глобулины. В течение 24 часов после операции значительно возрастает концентрация свободных жирных кислот. Концентрация АГК в плазме после операции также повышена, то же наблюдается и после травмы, тогда как концентрация альбумина в крови снижается. Все это может привести к изменению связывания лекарств с белками. Например, после операции связывание фенитоина снижается, скорее всего, вследствие снижения концентрации альбуминов, хотя может быть важной и конкуренция за рецептор вследствие повышения концентрации свободных жирных кислот. Напротив, связывание такого широко применяемого препарата, как хинидин, который соединяется с АГК, увеличивается в соответствии с увеличением концентрации АГК. Также повышение концентрации АГК наблюдается и после травмы, вследствие чего уменьшается свободная фракция лидокаина. Концентрация АГК в плазме достигает своего пика на 10-14 день после травмы и превышает нормальную примерно в три раза. После хирургического вмешательства связывание пропранолола будет увеличиваться в течение 24 часов, поскольку в этот же период увеличится и концентрация АГК.
  После кардиохирургических вмешательств связывание лидокаина также увеличивается, свободная фракция лидокаина уменьшается с 30.2% до 16.4% в течение 3 дней после операции. Это снижение свободной фракции лидокаина всегда будет наблюдаться на фоне повышения концентрации АГК в плазме на 200%. Концентрация альбумина после кардиохирургических вмешательств несколько уменьшается, возможно, вследствие комбинированного влияния искусственного кровообращения, гемодилюции и ускорения катаболизма после операции.
  Действие кардиохирургического вмешательства и искусственного кровообращения на изменение связывания препаратов с белками является комплексным. Введение гепарина при проведении искусственного кровообращения вызывает активацию липопротеинлипазы и увеличивает концентрацию свободных жирных кислот, свободные жирные кислоты конкурентно ингибируют процесс связывания препаратов с белками. Хотя in vivo клиренс свободных жирных кислот происходит достаточно быстро, чтобы повлиять на процесс связывания, уровень их в плазме после операции повышается примерно в шесть раз. Однако, если in vitro ингибировать липопротеин липазу, то концентрация свободных жирных кислот возрастает на 15-20%. Это увеличение in vitro после взятия пробы может вызвать конкуренцию за рецептор, что резко снижает связывание пропранолола и хинидина. Поскольку после взятия крови все равно в любом случае в образце концентрация свободных жирных кислот увеличивается, это не будет в значительной степени влиять на процесс связывания in vivo.
  Гемодилюция, связанная с искусственным кровообращением, также может влиять на связывание лекарств, не только вследствие гемодилюции как таковой, но и в связи с нефизиологичными концентрациями белков в растворе, которым заправляют агрегат. Во время искусственного кровообращения значительно падает концентрация альбуминов в плазме. Моделирование in vitro эффектов гемодилюции показало, что свободная фракция пропранолола несколько увеличивается - с 10.3 до 14.1%.

  Анестезия

  Ингаляционные анестетики в высоких концентрациях могут вызывать структурные изменения в белках, в том числе и в альбумине, что может изменить связывающую способность белка. Энфлуран, фторотан и метаболит фторотана, трифтороацетоновая кислота, могут вытеснять диазепам in vivo с человеческого альбумина. Энфлуран (1 минимальная альвеолярная коцентрация) также снижает связывание диазепама in vitro, в результате чего его свободная фракция в плазме достигает 60%. Связывание пропранолола и празозина в сыворотке не изменяется после ингаляций фторотана и энфлурана. Небольшое, но значительное уменьшение связывания пропранолола белками плазмы возникает у собак при анестезии фторотаном (2 минимальные альвеолярные концентрации). Информация о влиянии ингаляционных анестетиков на процесс связывания препаратов с белками весьма скудна и эта проблема нуждается в дальнейшем изучении.